初代組織塊培養(yǎng)法
1.剪切:把組織小塊置于小燒杯或小瓶中,用Hanks液漂洗二三次以去掉表面血污,吸靜Hanks液,用眼科剪反復剪切1mm3塊為止。
2.擺布:用彎頭吸管吸取若干小塊,置于培養(yǎng)瓶中,用吸管彎頭把組織小塊擺布在培養(yǎng)瓶底部,小塊相互距離以0.5cm為宜,每一25ml培養(yǎng)瓶底可擺布20~30塊。
3.輕輕翻轉培養(yǎng)瓶,另瓶底向上,注意翻瓶時勿另組織小塊流動,塞好瓶塞,置36.5℃溫箱培養(yǎng)2小時左右(勿超過4小時),使小塊微干涸。
4.培養(yǎng):從微箱中取出培養(yǎng)瓶,開塞,46度斜持培養(yǎng)瓶,箱瓶底腳部輕輕注入培養(yǎng)液少許,然后緩緩再把培養(yǎng)瓶翻轉過來,讓培養(yǎng)液慢慢覆蓋附于瓶地上的組織小塊。置溫箱中靜止培養(yǎng)。待細胞從組織塊游出數(shù)量增多后。再補加培養(yǎng)液。
傳代培養(yǎng)法
原理
細胞在培養(yǎng)瓶長成致密單層后,已基本上飽和,為使細胞能繼續(xù)生長,同時
也將細胞數(shù)量擴大,就必須進行傳代(再培養(yǎng))。 傳代培養(yǎng)也是一種將細胞種保存下去的方法。同時也是利用培養(yǎng)細胞進行各種實驗的必經(jīng)過程。懸浮型細胞直接分瓶就可以,而貼壁細胞需經(jīng)消化后才能分瓶。
材料和試劑
1.細胞:貼壁細胞株
2.試劑:0.25%、1640培養(yǎng)基(含10%小牛血清)
3.儀器和器材:倒置顯微鏡,培養(yǎng)箱、培養(yǎng)瓶、吸管、廢液缸等
操作步驟
1.吸除培養(yǎng)瓶內(nèi)舊培養(yǎng)液。
2.向瓶內(nèi)加入和EDTA混合液少許,以能覆滿瓶底為限。
3.置溫箱中2~5分鐘,當發(fā)現(xiàn)細胞質(zhì)回縮,細胞間隙增大后,立即終止消化。
4.吸除消化液,向瓶內(nèi)注入Hanks液數(shù)毫升,輕輕轉動培養(yǎng)瓶,把殘余消化液沖掉。注意加Hanks液沖洗細胞時,動作要輕,以免把已松動的細胞沖掉流失,如用液單獨消化,吸除液后,可不用Hanks液沖洗,直接加入培養(yǎng)液。
5.用吸管吸取營養(yǎng)液輕輕反復吹打瓶壁細胞,使之從瓶壁脫離形成細胞懸液。
6.計數(shù)板計數(shù)后,把細胞懸液分成等份分裝入數(shù)個培養(yǎng)瓶中,置溫箱中培養(yǎng)。
無菌操作注意事項
1.操作前要洗手,進入超凈臺后手要用75%酒精或0.2%新潔爾滅擦試。試劑等瓶口也要擦試。
2.點燃酒精燈,操作在火焰附近進行,耐熱物品要經(jīng)常在火焰上燒灼,金屬器械燒灼時間不能太長,以免退火,并冷卻后才能夾取組織,吸取過營養(yǎng)液的用具不能再燒灼,以免燒焦形成碳膜。
3.操作動作要準確敏捷,但又不能太快,以防空氣流動,增加污染機會。
4.不能用手觸已消毒器皿的工作部分,工作臺面上用品要布局合理。
5.瓶子開口后要盡量保持45℃斜位。
6.吸溶液的吸管等不能混用