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ELISA試劑盒定量方法的類(lèi)型和構(gòu)架
采用ELISA技術(shù)進(jìn)行定量的平臺(tái)化方法——一般來(lái)說(shuō)可以分為兩類(lèi),即間接法和直接法。
間接法也稱(chēng)為競(jìng)爭(zhēng)法,直接法也稱(chēng)雙抗夾心法。
今天,我們重點(diǎn)為大家介紹直接法。
直接法以定量抗原為例:
首先,以與抗原有強(qiáng)親和力的抗體包被固定在酶標(biāo)板材上,加入抗原標(biāo)準(zhǔn)品/樣品反應(yīng),再加入與抗原有強(qiáng)親和力的抗體并且偶聯(lián)了辣根過(guò)氧化氫酶HRP/堿性磷酸酶AP的酶聯(lián)抗體反應(yīng),后加入酶對(duì)應(yīng)的底物顯色,中間通過(guò)洗滌去除反應(yīng)體系中未結(jié)上的試劑成分。
這樣信號(hào)大小和抗原的濃度成正相關(guān),隨著反應(yīng)的進(jìn)行酶標(biāo)板材上固定的成分由抗體,轉(zhuǎn)變?yōu)榭贵w-抗原,后變?yōu)榭贵w-抗原-酶聯(lián)抗體,待測(cè)的抗原處于兩個(gè)抗體之間,所以也稱(chēng)為雙抗夾心法。
雙抗夾心法有一個(gè)關(guān)鍵點(diǎn):待檢測(cè)的物質(zhì)(如抗原)必須給包被抗體和酶聯(lián)抗體提供兩個(gè)結(jié)合位點(diǎn),這兩個(gè)位點(diǎn)可以是抗原上兩個(gè)以上相同的結(jié)構(gòu)位點(diǎn),也可以是不同的結(jié)構(gòu)位點(diǎn)。
一般來(lái)說(shuō),Elisa的構(gòu)架由標(biāo)準(zhǔn)品,內(nèi)控品,空白對(duì)照,基質(zhì)對(duì)照和待測(cè)樣品組成。
標(biāo)準(zhǔn)品
根據(jù)實(shí)驗(yàn)的具體應(yīng)用方向來(lái)源,標(biāo)準(zhǔn)品可以是已知濃度的/國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)品或者商業(yè)化的已知濃度的蛋白分子,也可以是自制的以其他方式定量(如紫外吸收定量)的純度較高的蛋白分子。標(biāo)準(zhǔn)品一般為7-8個(gè)濃度點(diǎn),擬合成合適的濃度-信號(hào)劑量曲線(xiàn)作為標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)進(jìn)行內(nèi)控品和樣品的定量。
內(nèi)控品
其中,內(nèi)控品是能夠使用的、獨(dú)立分裝的、特定濃度(高中低)的標(biāo)準(zhǔn)品,是監(jiān)控ELISA實(shí)驗(yàn)在單次實(shí)驗(yàn)中的質(zhì)量和的應(yīng)用過(guò)程中不同批次標(biāo)準(zhǔn)品的過(guò)渡橋接。
空白對(duì)照
空白對(duì)照為不含標(biāo)準(zhǔn)品的標(biāo)準(zhǔn)品溶液,基質(zhì)對(duì)照則為不含樣品的樣品溶液——兩者可能是一樣的成分,也可能是不同的成分,需要根據(jù)實(shí)驗(yàn)的具體情況進(jìn)行區(qū)分,目的是確認(rèn)ELISA體系中是否有非特異的交叉反應(yīng)。
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