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VE Elisa Kit試劑盒采用雙抗體一步夾心法酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)。往預(yù)先包被乙酰羧化酶合成酶(ACC)抗體的包被微孔中,依次加入標(biāo)本、標(biāo)準(zhǔn)品、HRP標(biāo)記的檢測抗體,經(jīng)過溫育并*洗滌。用底物TMB顯色,TMB在過氧化物酶的催化下轉(zhuǎn)化成藍(lán)色,并在酸的作用下轉(zhuǎn)化成zui終的黃色。顏色的深淺和樣品中的乙酰羧化酶合成酶(ACC)呈正相關(guān)。用酶標(biāo)儀在450nm 波長下測定吸光度(OD 值),計(jì)算樣品濃度。
樣品收集、處理及保存方法
1. 樣本不能含疊氮鈉(NaN3),因?yàn)榀B氮鈉(NaN3)是辣根過氧化物酶(HRP)的抑制劑。
2. 標(biāo)本采集后盡早進(jìn)行提取,提取按相關(guān)文獻(xiàn)進(jìn)行。
3. 植物萃取液或其它相關(guān)樣本:請1000 x g離心20分鐘,取上清即可檢測。
4. 保存:如果樣本收集后不及時(shí)檢測,請按一次用量分裝,凍存于-20℃,避免反復(fù)凍融,在室溫下解凍并確保樣品均勻地充分解凍。
植物乙酰羧化酶合成酶(ACC)ELISA試劑盒操作注意事項(xiàng)
試劑盒保存在2-8℃,使用前室溫平衡20分鐘。從冰箱取出的濃縮洗滌液會有結(jié)晶,這屬于正常現(xiàn)象,水浴加熱使結(jié)晶*溶解后再使用。
實(shí)驗(yàn)中不用的板條應(yīng)立即放回自封袋中,密封(低溫干燥)保存。
濃度為0的S0號標(biāo)準(zhǔn)品即可視為陰性對照或者空白;按照說明書操作時(shí)樣本已經(jīng)稀釋5倍,zui終結(jié)果乘以5才是樣本實(shí)際濃度。
嚴(yán)格按照VE Elisa Kit說明書中標(biāo)明的時(shí)間、加液量及順序進(jìn)行溫育操作。
所有液體組分使用前充分搖勻。
試劑盒組成
注:標(biāo)準(zhǔn)品(S0-S5)濃度依次為:0、1、2、4、8、16 U/L
試劑的準(zhǔn)備
20×洗滌緩沖液的稀釋:蒸餾水按1:20稀釋,即1份的20×洗滌緩沖液加19份的蒸餾水。
洗板方法
手工洗板:甩盡孔內(nèi)液體,每孔加滿洗滌液,靜置1min后甩盡孔內(nèi)液體,在吸水紙上拍干,如此洗板5次。
自動洗板機(jī):每孔注入洗液350μL,浸泡1min,洗板5次。
操作步驟
從室溫平衡20min后的鋁箔袋中取出所需板條,剩余板條用自封袋密封放回4℃。
設(shè)置標(biāo)準(zhǔn)品孔和樣本孔,標(biāo)準(zhǔn)品孔各加不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)品50μL;
樣本孔先加待測樣本10μL,再加樣本稀釋液40μL;空白孔不加。
除空白孔外,標(biāo)準(zhǔn)品孔和樣本孔中每孔加入辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記的檢測抗體100μL,用封板膜封住反應(yīng)孔,37℃水浴鍋或恒溫箱溫育60min。
棄去液體,吸水紙上拍干,每孔加滿洗滌液,靜置1min,甩去洗滌液,吸水紙上拍干,如此重復(fù)洗板5次(也可用洗板機(jī)洗板)。
每孔加入底物A、B各50μL,37℃避光孵育15min。
每孔加入終止液50μL,15min內(nèi),在450nm波長處測定各孔的OD值。
結(jié)果判斷
繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線:在Excel工作表中,以標(biāo)準(zhǔn)品濃度作橫坐標(biāo),對應(yīng)OD值作縱坐標(biāo),繪制出標(biāo)準(zhǔn)品線性回歸曲線,按曲線方程計(jì)算各樣本濃度值。
植物乙酰羧化酶合成酶(ACC)ELISA試劑盒試劑盒性能
1. 準(zhǔn)確性:標(biāo)準(zhǔn)品線性回歸與預(yù)期濃度相關(guān)系數(shù)R值,大于等于0.9900。
2. 靈敏度:zui低檢測濃度小于0.1 U/L。
3. 特異性:不與其它可溶性結(jié)構(gòu)類似物交叉反應(yīng)。
4. 重復(fù)性:板內(nèi)、板間變異系數(shù)均小于15%。
5. 貯藏:2-8℃,避光防潮保存。
6. VE Elisa Kit有效期:6個月