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實驗報告：

一、分離與培養(yǎng)：

1、無菌條件下，取出1-3d 齡SD大鼠心房組織，然后用PBS將此組織塊清洗2次，將組織剪成1mm3左右大??；

2、往組織塊中加入4 mL酶消化液（0.1% 和0.1% I型膠原酶），混懸10s，置37℃條件下消化10min，之后用滴管吹打制成單細(xì)胞懸液，自然沉淀并收集上清，用含10% FBS培養(yǎng)基終止消化后4℃放置；

3、剩下的組織再加入3～4mL酶消化液，混懸10s，置37℃消化10 min后，按上述方法收集上清并終止消化后4℃放置，重復(fù)此步驟2-3次，直至組織被消化；

4、用200目不銹鋼篩網(wǎng)過濾細(xì)胞消化液，1200r/min 離心10min，棄去上清，沉淀細(xì)胞用含有10％ FBS DMEM/F12培養(yǎng)基混懸，接種于25cm2培養(yǎng)瓶，放置于37℃ ，5％CO2 培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；

5、差速貼壁1h后，吸出培養(yǎng)基，按實驗需要接種于6孔板中繼續(xù)培養(yǎng)；二、免疫熒光鑒定：

1、待心房肌細(xì)胞生長至80%融合時，棄去培養(yǎng)基，用溫育的PBS沖洗細(xì)胞2次，每次10min，然后用4%多聚甲醛在室溫條件下固定細(xì)胞15min；

2、PBS沖洗細(xì)胞2次，每次10min，然后在4℃條件下，用0.1％Triton X-100透膜15min；

3、PBS沖洗細(xì)胞2次，每次10min，然后在室溫條件下，用4% BSA封閉細(xì)胞30min；

4、按1: 100的比例稀釋α-actin一抗，然后將其放在4℃冰箱中孵育細(xì)胞過夜；

5、PBS沖洗細(xì)胞3次，每次10min，按1：150的比例稀釋抗α-actin的二抗， 37℃條件下放置1h；

6、用PBS沖洗3次，每次10min，在倒置熒光顯微鏡下觀察圖像并拍照。

細(xì)胞簡介：

大鼠肺小動脈內(nèi)皮分離自肺小動脈組織；肺動脈干是短而粗的動脈，自右心室的動脈圓錐起始，向左后上方斜升，先在升主動脈根部的前面，繼而至其左側(cè)，至主動脈弓的下方，約在第5胸椎高度，分為左、右肺動脈。左肺動脈較短，橫行向左，經(jīng)左主支氣管前方至左肺門，分兩支進(jìn)入左肺的上、下葉。右肺動脈較長，橫行向右，經(jīng)主動脈升部和上腔靜脈的后方達(dá)右肺門，分3支進(jìn)入右肺上、中、下葉。左、右肺動脈的各分支在肺實質(zhì)內(nèi)又反復(fù)分支，與支氣管的分支伴行，最后達(dá)肺泡壁，形成稠密的毛細(xì)血管網(wǎng)。肺動脈輸送的是含二氧化碳較多的靜脈血。在肺動脈干分叉處稍左側(cè)與主動脈弓下緣之間有一結(jié)締組織索，稱動脈韌帶。管徑在0.3～1mm之間，為小動脈（small-artery），小動脈包括粗細(xì)不等的幾級分支，也屬肌性動脈。較大的小動脈，內(nèi)膜有明顯的內(nèi)彈性膜，中膜有幾層平滑肌，外膜厚度與中膜相近，一般沒有外彈性膜?？趶皆?span>1mm以下的動脈，管壁有完整的平滑肌層及少量的彈性纖維和膠質(zhì)纖維。小動脈是決定周圍循環(huán)阻力大小的主要因素，也是調(diào)節(jié)微循環(huán)灌注量的“總開關(guān)"。典型的小動脈，其管壁的厚度與管徑相比約為1∶2。中膜的肌層相對比其他動脈為厚，當(dāng)平滑肌在神經(jīng)支配下強(qiáng)力收縮時，其管腔可以閉塞，而使血液不能流入它所分布的毛細(xì)血管內(nèi)，從而增加了周圍血液循環(huán)的阻力。如果有許多小動脈同時收縮，可使血壓顯著上升。反之，當(dāng)小動脈的平滑肌舒張時，則可使大量的血液流入毛細(xì)血管，外周阻力明顯下降，血壓降低。終末小動脈(terminal arteri-ole)的口徑為20～30μm；后小動脈(metar-teriole)，又稱毛細(xì)血管前小動脈(precapil-lary arteriole)的口徑為12～15μm。管壁內(nèi)均有較稀疏的平滑肌，在毛細(xì)血管前小動脈分支的起始部分，管壁平滑肌成分增厚，叫做毛細(xì)血管前括約肌(precapillary sphinc-ter)，其收縮或舒張，可調(diào)節(jié)真毛細(xì)血管的血流量，是調(diào)節(jié)微循環(huán)灌注量的“分開關(guān)"。支配小動脈平滑肌的交感神經(jīng)纖維，可延伸到終末小動脈和后小動脈的平滑肌細(xì)胞。在毛細(xì)血管前括約肌上交感神經(jīng)纖維特別豐富。肺小動脈內(nèi)皮細(xì)胞呈單層多角形鋪路石狀分布，該細(xì)胞在維持血管內(nèi)外的動態(tài)平衡、合成和分泌細(xì)胞因子和介質(zhì)、維持凝血和纖溶的動態(tài)平衡中起重要作用。

方法簡介：

實驗室分離的大鼠肺小動脈內(nèi)皮采用-膠原酶聯(lián)合消化法結(jié)合差速貼壁法、并通過內(nèi)皮細(xì)胞專用培養(yǎng)基培養(yǎng)篩選制備而來，細(xì)胞總量約為5×10?cells/瓶。

質(zhì)量檢測

實驗室分離的大鼠肺小動脈內(nèi)皮經(jīng)CD31免疫熒光鑒定，純度可達(dá)90%以上，且不含有HIV-1、HBV、HCV、支原體、細(xì)菌、酵母和真菌等。

培養(yǎng)信息：

包被條件：PLL（0.1mg/ml），明膠（0.1%）

培養(yǎng)基：基礎(chǔ)培養(yǎng)基，含FBS、EGF、bFGF、IGF、VEGF、Heparin、Hydrocortisone、Penicillin、Streptomycin等

換液頻率：每2-3天換液一次

生長特性：貼壁

細(xì)胞形態(tài)：內(nèi)皮細(xì)胞樣

傳代特性：可傳2-3代

消化液：0.25%

培養(yǎng)條件：氣相：空氣，95%；CO2，5%

大鼠肺小動脈內(nèi)皮體外培養(yǎng)周期有限；建議使用配套的專用生長培養(yǎng)基及正確的操作方法來培養(yǎng)，以此保證該細(xì)胞的培養(yǎng)狀態(tài)。

注意事項：

1. 收到細(xì)胞后首先觀察細(xì)胞瓶是否完好，培養(yǎng)液是否有漏液、渾濁等現(xiàn)象，若有上述現(xiàn)象發(fā)生請及時和我們聯(lián)系。

2. 仔細(xì)閱讀細(xì)胞說明書，了解細(xì)胞相關(guān)信息，如細(xì)胞形態(tài)、所用培養(yǎng)基、血清比例、所需細(xì)胞因子等，確保細(xì)胞培養(yǎng)條件一致，若由于培養(yǎng)條件不一致而導(dǎo)致細(xì)胞出現(xiàn)問題，責(zé)任由客戶自行承擔(dān)。

3. 用75%酒精擦拭細(xì)胞瓶表面，顯微鏡下觀察細(xì)胞狀態(tài)。因運輸問題，部分細(xì)胞由于溫度變化及劇烈碰亡破碎形成碎片，是正?，F(xiàn)象。觀察好細(xì)胞狀態(tài)后，75%酒精消毒瓶壁將T25瓶置于37℃培養(yǎng)箱放置4-6h。

4. 貼壁細(xì)胞可以消化，懸浮細(xì)胞直接混勻收集細(xì)胞，900 rpm-1000 rpm離心3 min，棄上清。加5 mL PBS重懸細(xì)胞，再900 rpm-1000 rpm離心3 min，，用新鮮的*培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，并接種到新的培養(yǎng)瓶或培養(yǎng)皿中，置于培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)。

5. 請客戶用相同條件的培養(yǎng)基用于細(xì)胞培養(yǎng)。

6. 建議客戶收到細(xì)胞后前3天各拍幾張細(xì)胞照片，記錄細(xì)胞狀態(tài)，便于和我司技術(shù)部溝通交流。由于運輸?shù)脑?，個別敏感細(xì)胞會出現(xiàn)不穩(wěn)定的情況，請及時和我們聯(lián)系，告知細(xì)胞的具體情況，以便我們的技術(shù)人員跟蹤回訪直至問題解決。

7. 該細(xì)胞僅供科研使用。

8. 備注：運輸用的培養(yǎng)基(灌液培養(yǎng)基)不能再用來培養(yǎng)細(xì)胞，請換用按照說明書細(xì)胞培養(yǎng)條件新配制的*培養(yǎng)基來培養(yǎng)細(xì)胞。收到細(xì)胞后次傳代建議1：2傳代 。

9.注意： 1:2傳代就是1個T25瓶傳2個T25瓶或者2個6cm皿。不是1個T25瓶傳2個10cm皿。

公司正在出售的產(chǎn)品：

大鼠過氧化物酶體增殖物激活受體α(PPAR-α)檢測試劑盒 ，英文名： PPAR-α ELISA Kit

Rabbit acetylcholine (ACh) ELISA Kit 兔乙酰(ACh)檢測試劑盒

柯薩奇病毒A16型(CAV-16)核酸檢測試劑盒(-PCR法) 48T

CLIAKitforMMSAM(Humanmelanomametastasissurfaceadhesionmolecule)ELISAKit人黑色素瘤轉(zhuǎn)移表面黏附分子

體液基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP)總活性比色法定量檢測試劑盒20次

ELISAKitFA犬

TGFB1重組狗 TGF-beta 1 / TGFB1 蛋白 Protein

Nestin 巢蛋白(神經(jīng)上皮干細(xì)胞蛋白 0.5mgNestin 巢蛋白(神經(jīng)上皮干細(xì)胞蛋白)(抗原)

L10重組人 IL10 / Interleukin-10 蛋白 Protein

CASP3 Protein Human 重組人 CASP3 / Caspase-3 / CASP-3 蛋白

CSK Protein Mouse 重組小鼠 CSK / C-Src kinase 蛋白

Nestin 巢蛋白(神經(jīng)上皮干細(xì)胞蛋白 0.5mgNestin 巢蛋白(神經(jīng)上皮干細(xì)胞蛋白)(抗原)

CASP3 Protein Human 重組人 CASP3 / Caspase-3 / CASP-3 蛋白

TGFB1重組狗 TGF-beta 1 / TGFB1 蛋白 Protein

CSK Protein Mouse 重組小鼠 CSK / C-Src kinase 蛋白

L10重組人 IL10 / Interleukin-10 蛋白 Protein

小鼠總蛋白(TP)檢測試劑盒 96T/48T

Human ai sperm aibody (glycolipid) ELISA Kit 人抗糖脂抗體(glycolipid)檢測試劑盒

HumanE1/ubiquitin-activatingenzyme,E1/UBAEELISAKit 人泛素激活酶(E1/UBAE)檢測試劑盒 96T/48T 進(jìn)口分裝

CLIAKitforACEELISAKit大鼠血管緊張素轉(zhuǎn)化酶

藥品糖精(saccharin)含量薄層色譜法定性檢測試劑盒20次

Mousepara-aminobenzoicacid,PABAELISAKit小鼠對(PABA)檢測試劑盒規(guī)格：96T/48T

大鼠肺小動脈內(nèi)皮細(xì)胞鴨免疫球蛋白E(IgE)ELISAKit   ELISA.   96T/48T

鴨主要組織相容性復(fù)合體(MHC)ELISAKit   ELISA.   96T/48T

鴨病毒性腸病毒(DEV)ELISAKit   ELISA.   96T/48T

鴨白介素6(IL-6)ELISAKit   ELISA.   96T/48T