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實(shí)驗(yàn)報(bào)告：

一、分離與培養(yǎng)：

1、無(wú)菌條件下，取出1-3d 齡SD大鼠心房組織，然后用PBS將此組織塊清洗2次，將組織剪成1mm3左右大??；

2、往組織塊中加入4 mL酶消化液（0.1% 和0.1% I型膠原酶），混懸10s，置37℃條件下消化10min，之后用滴管吹打制成單細(xì)胞懸液，自然沉淀并收集上清，用含10% FBS培養(yǎng)基終止消化后4℃放置；

3、剩下的組織再加入3～4mL酶消化液，混懸10s，置37℃消化10 min后，按上述方法收集上清并終止消化后4℃放置，重復(fù)此步驟2-3次，直至組織被消化；

4、用200目不銹鋼篩網(wǎng)過(guò)濾細(xì)胞消化液，1200r/min 離心10min，棄去上清，沉淀細(xì)胞用含有10％ FBS DMEM/F12培養(yǎng)基混懸，接種于25cm2培養(yǎng)瓶，放置于37℃ ，5％CO2 培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；

5、差速貼壁1h后，吸出培養(yǎng)基，按實(shí)驗(yàn)需要接種于6孔板中繼續(xù)培養(yǎng)；二、免疫熒光鑒定：

1、待心房肌細(xì)胞生長(zhǎng)至80%融合時(shí)，棄去培養(yǎng)基，用溫育的PBS沖洗細(xì)胞2次，每次10min，然后用4%多聚甲醛在室溫條件下固定細(xì)胞15min；

2、PBS沖洗細(xì)胞2次，每次10min，然后在4℃條件下，用0.1％Triton X-100透膜15min；

3、PBS沖洗細(xì)胞2次，每次10min，然后在室溫條件下，用4% BSA封閉細(xì)胞30min；

4、按1: 100的比例稀釋?duì)?actin一抗，然后將其放在4℃冰箱中孵育細(xì)胞過(guò)夜；

5、PBS沖洗細(xì)胞3次，每次10min，按1：150的比例稀釋抗α-actin的二抗， 37℃條件下放置1h；

6、用PBS沖洗3次，每次10min，在倒置熒光顯微鏡下觀(guān)察圖像并拍照。

細(xì)胞簡(jiǎn)介：

小鼠大隱靜脈平滑肌分離自大隱靜脈；大隱靜脈起于足背靜脈弓內(nèi)側(cè)端，經(jīng)內(nèi)踝前方，沿小腿內(nèi)側(cè)緣伴隱神經(jīng)上行，經(jīng)股骨內(nèi)側(cè)髁后方，進(jìn)入大腿內(nèi)側(cè)部，與股內(nèi)側(cè)皮神經(jīng)伴行，逐漸向前上，在恥骨結(jié)節(jié)外下方穿隱靜脈裂孔，匯入股靜脈，其匯入點(diǎn)稱(chēng)為隱股點(diǎn)。有5條屬支：旋髂淺靜脈、腹壁淺靜脈、外靜脈、股內(nèi)側(cè)淺靜脈和股外側(cè)淺靜脈，它們匯入大隱靜脈的形式多樣，相互間吻合豐富。大隱靜脈曲張行高位結(jié)扎時(shí)，須分別結(jié)扎、切斷各屬支，以防復(fù)發(fā)。大隱靜脈平滑肌細(xì)胞主要功能：①血管平滑肌細(xì)胞的生長(zhǎng)潛力是原發(fā)血管病發(fā)的重要異常因素；②參與血管壁的炎癥反應(yīng)，并與血管疾病的進(jìn)展和穩(wěn)定有關(guān)。因此，研究大隱靜脈平滑肌細(xì)胞的代謝和信號(hào)通路是研究大隱靜脈擴(kuò)張等疾病的良好實(shí)驗(yàn)材料。大隱靜脈平滑肌細(xì)胞原代分離培養(yǎng)3天后，可見(jiàn)細(xì)胞貼壁伸展，細(xì)胞形態(tài)大小不一，呈梭形、不規(guī)則形、三角形或扇形，核卵圓形、居中；2周后細(xì)胞匯合，多數(shù)細(xì)胞伸展呈長(zhǎng)梭形，胞漿豐富，有分枝狀突起，細(xì)胞平行排列成單層或部分區(qū)域多層重疊生長(zhǎng)，高低起伏；細(xì)胞密度低時(shí)，常交織成網(wǎng)狀；密度高時(shí)，則排列為旋渦狀或柵欄狀。傳代后細(xì)胞生長(zhǎng)較快，4-6天即可匯合，并保持上述形態(tài)學(xué)特征和生長(zhǎng)特點(diǎn)。

方法簡(jiǎn)介：

公司實(shí)驗(yàn)室分離的小鼠大隱靜脈平滑肌采用-膠原酶聯(lián)合消化法結(jié)合差速貼壁法制備而來(lái)，細(xì)胞總量約為5×10?cells/瓶。

質(zhì)量檢測(cè)

公司實(shí)驗(yàn)室分離的小鼠大隱靜脈平滑肌經(jīng)α-SMA免疫熒光鑒定，純度可達(dá)90%以上，且不含有HIV-1、HBV、HCV、支原體、細(xì)菌、酵母和真菌等。

培養(yǎng)信息：

培養(yǎng)基 含FBS、生長(zhǎng)添加劑、Penicillin、Streptomycin等

換液頻率 每2-3天換液一次

生長(zhǎng)特性 貼壁

細(xì)胞形態(tài) 成纖維細(xì)胞樣

傳代特性 可傳3代左右

消化液 0.25%

培養(yǎng)條件 氣相：空氣，95%；CO2，5%

注意事項(xiàng)：

1. 收到細(xì)胞后首先觀(guān)察細(xì)胞瓶是否完好，培養(yǎng)液是否有漏液、渾濁等現(xiàn)象，若有上述現(xiàn)象發(fā)生請(qǐng)及時(shí)和我們聯(lián)系。

2. 仔細(xì)閱讀細(xì)胞說(shuō)明書(shū)，了解細(xì)胞相關(guān)信息，如細(xì)胞形態(tài)、所用培養(yǎng)基、血清比例、所需細(xì)胞因子等，確保細(xì)胞培養(yǎng)條件一致，若由于培養(yǎng)條件不一致而導(dǎo)致細(xì)胞出現(xiàn)問(wèn)題，責(zé)任由客戶(hù)自行承擔(dān)。

3. 用75%酒精擦拭細(xì)胞瓶表面，顯微鏡下觀(guān)察細(xì)胞狀態(tài)。因運(yùn)輸問(wèn)題，部分細(xì)胞由于溫度變化及劇烈碰亡破碎形成碎片，是正?，F(xiàn)象。觀(guān)察好細(xì)胞狀態(tài)后，75%酒精消毒瓶壁將T25瓶置于37℃培養(yǎng)箱放置4-6h。

4. 貼壁細(xì)胞可以消化，懸浮細(xì)胞直接混勻收集細(xì)胞，900 rpm-1000 rpm離心3 min，棄上清。加5 mL PBS重懸細(xì)胞，再900 rpm-1000 rpm離心3 min，，用新鮮的*培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，并接種到新的培養(yǎng)瓶或培養(yǎng)皿中，置于培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)。

5. 請(qǐng)客戶(hù)用相同條件的培養(yǎng)基用于細(xì)胞培養(yǎng)。

6. 建議客戶(hù)收到細(xì)胞后前3天各拍幾張細(xì)胞照片，記錄細(xì)胞狀態(tài)，便于和我司技術(shù)部溝通交流。由于運(yùn)輸?shù)脑?，個(gè)別敏感細(xì)胞會(huì)出現(xiàn)不穩(wěn)定的情況，請(qǐng)及時(shí)和我們聯(lián)系，告知細(xì)胞的具體情況，以便我們的技術(shù)人員跟蹤回訪(fǎng)直至問(wèn)題解決。

7. 該細(xì)胞僅供科研使用。

8. 備注：運(yùn)輸用的培養(yǎng)基(灌液培養(yǎng)基)不能再用來(lái)培養(yǎng)細(xì)胞，請(qǐng)換用按照說(shuō)明書(shū)細(xì)胞培養(yǎng)條件新配制的*培養(yǎng)基來(lái)培養(yǎng)細(xì)胞。收到細(xì)胞后次傳代建議1：2傳代 。

9.注意： 1:2傳代就是1個(gè)T25瓶傳2個(gè)T25瓶或者2個(gè)6cm皿。不是1個(gè)T25瓶傳2個(gè)10cm皿。

公司正在出售的產(chǎn)品：

大鼠Bcl-2相關(guān)X蛋白(BAX)檢測(cè)試劑盒 ，英文名： BAX ELISA Kit

Mouse bone morphogenetic protein 7 (BMP-7) ELISA Kit 小鼠骨成型蛋白7(BMP-7)檢測(cè)試劑盒

Mouseosteonectin,ONELISAKit 小鼠骨粘連蛋白(ON)檢測(cè)試劑盒 96T/48T 進(jìn)口分裝

CLIAKitforHumahymosinELISAKit人

通用型煙草花葉病毒(TobaccoMosaicVirus;TMV)基因定量檢測(cè)試劑盒20次

ELISAKitHSF1大鼠熱休克因子1

4%溶液 500ml

Trk C 神經(jīng)生長(zhǎng)因子受體的一種(抗原 0.5mgTrk C 神經(jīng)生長(zhǎng)因子受體的一種(抗原)

RSPO1重組人 R-Spondin 1 / RSPO1 蛋白 Protein

GLT8D2 Protein Human 重組人 GLT8D2 蛋白

EFNA5 Protein Human 重組人 Ephrin-A5 / EFNA5 蛋白

Trk C 神經(jīng)生長(zhǎng)因子受體的一種(抗原 0.5mgTrk C 神經(jīng)生長(zhǎng)因子受體的一種(抗原)

GLT8D2 Protein Human 重組人 GLT8D2 蛋白

4%溶液 500ml

EFNA5 Protein Human 重組人 Ephrin-A5 / EFNA5 蛋白

RSPO1重組人 R-Spondin 1 / RSPO1 蛋白 Protein

小鼠白介素18(IL-18)ELISA 試劑盒 96T/48T

Three rat iiodothyronine (T3) ELISA Kit 大鼠三甲狀腺原(T3)檢測(cè)試劑盒

HumanOsteopoin,OPNELISAKit 人骨橋素(OPN)檢測(cè)試劑盒 96T/48T 進(jìn)口分裝

HumanCailageglycoprotein39,HCgp-39檢測(cè)試劑盒人軟骨糖蛋白39(HCgp-39)檢測(cè)試劑盒規(guī)格：96T/48T

轉(zhuǎn)基因大豆GTS40.3.2品系試劑盒20次

HumanSolubleAdenylateCyclase,sACELISAKit人可溶性腺苷酸環(huán)化酶(sAC)檢測(cè)試劑盒規(guī)格：96T/48T

小鼠大隱靜脈平滑肌細(xì)胞兔子環(huán)0酸腺苷(cAMP)檢測(cè)試劑盒   96T/48T   試劑盒   組裝/原裝

兔子紅細(xì)胞生成素(EPO)檢測(cè)試劑盒   96T/48T   試劑盒   組裝/原裝

兔子骨膠原交聯(lián)(Cr)檢測(cè)試劑盒   96T/48T   試劑盒   組裝/原裝

兔子睪(T)檢測(cè)試劑盒   96T/48T   試劑盒   組裝/原裝