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實驗報告：

一、分離與培養(yǎng)：

1、無菌條件下，取出1-3d 齡SD大鼠心房組織，然后用PBS將此組織塊清洗2次，將組織剪成1mm3左右大小；

2、往組織塊中加入4 mL酶消化液（0.1% 和0.1% I型膠原酶），混懸10s，置37℃條件下消化10min，之后用滴管吹打制成單細胞懸液，自然沉淀并收集上清，用含10% FBS培養(yǎng)基終止消化后4℃放置；

3、剩下的組織再加入3～4mL酶消化液，混懸10s，置37℃消化10 min后，按上述方法收集上清并終止消化后4℃放置，重復此步驟2-3次，直至組織被消化；

4、用200目不銹鋼篩網(wǎng)過濾細胞消化液，1200r/min 離心10min，棄去上清，沉淀細胞用含有10％ FBS DMEM/F12培養(yǎng)基混懸，接種于25cm2培養(yǎng)瓶，放置于37℃ ，5％CO2 培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；

5、差速貼壁1h后，吸出培養(yǎng)基，按實驗需要接種于6孔板中繼續(xù)培養(yǎng)；二、免疫熒光鑒定：

1、待心房肌細胞生長至80%融合時，棄去培養(yǎng)基，用溫育的PBS沖洗細胞2次，每次10min，然后用4%多聚甲醛在室溫條件下固定細胞15min；

2、PBS沖洗細胞2次，每次10min，然后在4℃條件下，用0.1％Triton X-100透膜15min；

3、PBS沖洗細胞2次，每次10min，然后在室溫條件下，用4% BSA封閉細胞30min；

4、按1: 100的比例稀釋α-actin一抗，然后將其放在4℃冰箱中孵育細胞過夜；

5、PBS沖洗細胞3次，每次10min，按1：150的比例稀釋抗α-actin的二抗， 37℃條件下放置1h；

6、用PBS沖洗3次，每次10min，在倒置熒光顯微鏡下觀察圖像并拍照。

細胞簡介：

大鼠精原分離自睪丸組織；睪丸呈微扁的卵圓形，表面光滑，覆蓋著鞘膜臟層；深部是質地堅韌的白膜，在睪丸后緣增厚并進入睪丸，形成睪丸縱膈，縱膈發(fā)出許多睪丸小隔深入睪丸實質，將實質分為睪丸小葉，數(shù)量約為100～200。每個小葉內約有2～4條生精小管，具有產(chǎn)生精子的作用；生精小管之間的結締組織中有睪丸間質細胞，具有產(chǎn)生雄激素的作用。生精小管首先匯合成為精直小管(也稱直精小管)，精直小管進入睪丸縱膈形成睪丸網(wǎng)，之后睪丸網(wǎng)發(fā)出12～15條輸出小管通過睪丸后上緣進入附睪。生精小管的生精上皮是精子產(chǎn)生的地方，由生精細胞和支持細胞構成，成人的生精小管有30～70cm長。精子的產(chǎn)生過程包括生精細胞的分化、支持細胞的作用、雄激素的調節(jié)等。生精細胞并不是一種細胞，它是多種細胞的統(tǒng)稱，包括精原細胞、初級精母細胞、次級精母細胞、精子細胞、精子。前者依次發(fā)育分化為后者，且依次從生精上皮的基部到管腔面排列，終形成精子進入到管腔之中，并借助生精上皮外側的肌樣細胞的收縮作用向下一級管腔移動。精原細胞是指由睪丸精子管上皮的原始生殖細胞經(jīng)過多次有絲分裂而形成的細胞。原始的胚細胞經(jīng)分化形成精原細胞，精原細胞經(jīng)復制形成初級精母細胞，初級精母細胞經(jīng)過減數(shù)次分裂后形成次級精母細胞，再經(jīng)過減數(shù)次分裂形成精細胞。精細胞經(jīng)過變形終形成精子。精原細胞屬于雄性生殖細胞的早期發(fā)育階段，能不斷地進行有絲分裂，增加細胞數(shù)量，并分化為精母細胞。精原細胞貼近基膜，細胞呈圓形，核大而圓，梁色深。精原細胞在男性的一生中具有幾乎無限分裂的能力，而且分裂過程中能夠保持原有的基因性狀不變。在增殖過程中，通過精原細胞的分裂和分化，由精原細胞產(chǎn)生精母細胞，進入成熟分裂，因而通過增殖可大大增加精母細胞的數(shù)量。按理論推算，一個精原細胞通過數(shù)次細胞分裂，可形成上百個初級精母細胞。但在生精過程早期，生精細胞很易發(fā)生變性，故實際上少于這個數(shù)字。在精原細胞的增殖過程中，有一部分Ad型精原細胞不再繼續(xù)分裂，而是保留下來，成為新的精原干細胞，因此通過增殖不僅能使精原干細胞不斷得到更新，且能使精原干細胞保持一定數(shù)量，從而使精子的產(chǎn)生持續(xù)地進行下去，不會枯竭。

方法簡介：

實驗室分離的大鼠精原采用混合酶多步消化法制備而來，細胞總量約為5×10?cells/瓶。

質量檢測

實驗室分離的大鼠精原經(jīng)AP(堿性磷酸酶)免疫組化染色鑒定，純度可達90%以上，且不含有HIV-1、HBV、HCV、支原體、細菌、酵母和真菌等。

培養(yǎng)信息：

培養(yǎng)基：含FBS、生長添加劑、GDNF、Penicillin、Streptomycin等

換液頻率：每2-3天換液一次

生長特性：貼壁

細胞形態(tài)：圓形、橢圓形

傳代特性：可傳2-3代左右

消化液：0.25%

培養(yǎng)條件：氣相：空氣，95%；CO2，5%

大鼠精原體外培養(yǎng)周期有限；建議使用配套的專用生長培養(yǎng)基及正確的操作方法來培養(yǎng)，以此保證該細胞的佳培養(yǎng)狀態(tài)。

注意事項：

1. 收到細胞后首先觀察細胞瓶是否完好，培養(yǎng)液是否有漏液、渾濁等現(xiàn)象，若有上述現(xiàn)象發(fā)生請及時和我們聯(lián)系。

2. 仔細閱讀細胞說明書，了解細胞相關信息，如細胞形態(tài)、所用培養(yǎng)基、血清比例、所需細胞因子等，確保細胞培養(yǎng)條件一致，若由于培養(yǎng)條件不一致而導致細胞出現(xiàn)問題，責任由客戶自行承擔。

3. 用75%酒精擦拭細胞瓶表面，顯微鏡下觀察細胞狀態(tài)。因運輸問題，部分細胞由于溫度變化及劇烈碰亡破碎形成碎片，是正?，F(xiàn)象。觀察好細胞狀態(tài)后，75%酒精消毒瓶壁將T25瓶置于37℃培養(yǎng)箱放置4-6h。

4. 貼壁細胞可以消化，懸浮細胞直接混勻收集細胞，900 rpm-1000 rpm離心3 min，棄上清。加5 mL PBS重懸細胞，再900 rpm-1000 rpm離心3 min，，用新鮮的*培養(yǎng)基重懸細胞，并接種到新的培養(yǎng)瓶或培養(yǎng)皿中，置于培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng)。

5. 請客戶用相同條件的培養(yǎng)基用于細胞培養(yǎng)。

6. 建議客戶收到細胞后前3天各拍幾張細胞照片，記錄細胞狀態(tài)，便于和我司技術部溝通交流。由于運輸?shù)脑?，個別敏感細胞會出現(xiàn)不穩(wěn)定的情況，請及時和我們聯(lián)系，告知細胞的具體情況，以便我們的技術人員跟蹤回訪直至問題解決。

7. 該細胞僅供科研使用。

8. 備注：運輸用的培養(yǎng)基(灌液培養(yǎng)基)不能再用來培養(yǎng)細胞，請換用按照說明書細胞培養(yǎng)條件新配制的*培養(yǎng)基來培養(yǎng)細胞。收到細胞后次傳代建議1：2傳代 。

9.注意： 1:2傳代就是1個T25瓶傳2個T25瓶或者2個6cm皿。不是1個T25瓶傳2個10cm皿。

公司正在出售的產(chǎn)品：

兔子補體片斷3a(C3a)試劑盒   96T/48T

兔子補體蛋白4(C4)試劑盒   96T/48T

兔子表皮生長因子(EGF)試劑盒   96T/48T

兔子白血病抑制因子受體(LIFR)試劑盒   96T/48T

小鼠八聚體結合轉錄因子4(OCT4)試劑盒 96T/48T

Rat epinephrine (EPI) ELISA Kit 大鼠(EPI)試劑盒

Humanbonealkalinephosphatase,BALPELISAKit 人骨堿性0酸酶(BALP)試劑盒 96T/48T 進口分裝

Humancatecholamine,CA試劑盒人兒茶酚胺(CA)試劑盒規(guī)格：96T/48T

轉基因油菜(canola)HCN92品系試劑盒20次

humansimilaoRIKENcDNA2610307008geneELISAKit人類似RIKENcDNA2610307008基因試劑盒規(guī)格：96T/48T

MEP1A重組小鼠 MEP1A 蛋白 Protein

CCP peptide (cyclic citrullinated peptide,CCP 0.5mgCCP peptide (cyclic citrullinated peptide,CCP) 瓜環(huán)肽

UBE2D4重組人 UBE2D4 蛋白 Protein

GOLM1 Protein Human 重組人 GOLM1 / GP73 蛋白

TGFB1 Protein Rat 重組大鼠 Latent TGF-beta 1 / TGFB1 蛋白

bovine Insulin protein 牛胰島素蛋白 10mgbovine Insulin protein 牛胰島素蛋白

GOLM1 Protein Human 重組人 GOLM1 / GP73 蛋白

THSD1重組小鼠 THSD1 / TMTSP 蛋白 Protein

MBL1 Protein Rat 重組大鼠 MBL1 蛋白 (Fc 標簽)

BMPR1B重組人 BMPR1B / ALK-6 (149-502) 蛋白 (His & GST 標簽) Protein

大鼠精原細胞大鼠白三烯E4(LTE4)試劑盒 ，英文名： LTE4 ELISA Kit

Mouse beta glucosidase (beta -glucosidase) ELISA Kit 小鼠β葡糖苷酶(β-glucosidase)試劑盒

ELISA 小鼠胃泌素(mouse Gasin)  進口分裝

CLIAKitforIRF(HumanierferoegulatoryFactor)ELISAKit人干擾素調節(jié)因子

通用型番茄瘡痂病辣椒斑點病菌(Xahomonascampesispv.vesicatoria;Xcv)試劑盒20次

NGAL大鼠中性粒細胞明膠酶相關脂質運載蛋白