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實(shí)驗報告：

一、分離與培養(yǎng)：

1、無菌條件下，取出1-3d 齡SD大鼠心房組織，然后用PBS將此組織塊清洗2次，將組織剪成1mm3左右大??；

2、往組織塊中加入4 mL酶消化液（0.1% 和0.1% I型膠原酶），混懸10s，置37℃條件下消化10min，之后用滴管吹打制成單細(xì)胞懸液，自然沉淀并收集上清，用含10% FBS培養(yǎng)基終止消化后4℃放置；

3、剩下的組織再加入3～4mL酶消化液，混懸10s，置37℃消化10 min后，按上述方法收集上清并終止消化后4℃放置，重復(fù)此步驟2-3次，直至組織被消化；

4、用200目不銹鋼篩網(wǎng)過濾細(xì)胞消化液，1200r/min 離心10min，棄去上清，沉淀細(xì)胞用含有10％ FBS DMEM/F12培養(yǎng)基混懸，接種于25cm2培養(yǎng)瓶，放置于37℃ ，5％CO2 培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；

5、差速貼壁1h后，吸出培養(yǎng)基，按實(shí)驗需要接種于6孔板中繼續(xù)培養(yǎng)；二、免疫熒光鑒定：

1、待心房肌細(xì)胞生長至80%融合時，棄去培養(yǎng)基，用溫育的PBS沖洗細(xì)胞2次，每次10min，然后用4%多聚甲醛在室溫條件下固定細(xì)胞15min；

2、PBS沖洗細(xì)胞2次，每次10min，然后在4℃條件下，用0.1％Triton X-100透膜15min；

3、PBS沖洗細(xì)胞2次，每次10min，然后在室溫條件下，用4% BSA封閉細(xì)胞30min；

4、按1: 100的比例稀釋α-actin一抗，然后將其放在4℃冰箱中孵育細(xì)胞過夜；

5、PBS沖洗細(xì)胞3次，每次10min，按1：150的比例稀釋抗α-actin的二抗， 37℃條件下放置1h；

6、用PBS沖洗3次，每次10min，在倒置熒光顯微鏡下觀察圖像并拍照。

細(xì)胞簡介：

大鼠胰腺導(dǎo)管上皮分離自胰腺組織；胰腺分為外分泌腺和內(nèi)分泌腺兩部分。外分泌腺由腺泡和腺管組成，腺泡分泌胰液，腺管是胰液排出的通道。胰液中含有、原、脂肪酶、等。胰液通過胰腺管排入十二指腸，有消化蛋白質(zhì)、脂肪和糖的作用。內(nèi)分泌腺由大小不同的細(xì)胞團(tuán)──胰島所組成，胰島主要由4種細(xì)胞組成：α細(xì)胞、β細(xì)胞、γ細(xì)胞及PP細(xì)胞。α細(xì)胞分泌胰高血糖素，升高血糖；β細(xì)胞分泌胰島素，降低血糖；γ細(xì)胞分泌，以旁分泌的方式抑制α、β細(xì)胞的分泌；PP細(xì)胞分泌胰多肽，抑制胃腸運(yùn)動、胰液分泌和膽囊收縮。成體胰腺導(dǎo)管上皮細(xì)胞作為胰腺前體細(xì)胞，已證實(shí)具多向分化潛能，在合適的外源性刺激下可分化成胰島樣細(xì)胞，胰腺導(dǎo)管上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)分化的胰島樣細(xì)胞免疫原性如何，轉(zhuǎn)分化的胰島樣細(xì)胞在治療糖尿病時是否發(fā)生免疫排斥反應(yīng)，對干細(xì)胞臨床治療糖尿病具有重要意義。

方法簡介：

公司實(shí)驗室分離的大鼠胰腺導(dǎo)管上皮采用-膠原酶混合消化法結(jié)合密度梯度離心法、差速貼壁法，并通過上皮細(xì)胞專用培養(yǎng)基培養(yǎng)篩選制備而來，細(xì)胞總量約為5×10?cells/瓶。

質(zhì)量檢測

公司實(shí)驗室分離的大鼠胰腺導(dǎo)管上皮經(jīng)Cytokeratin-19免疫熒光鑒定，純度可達(dá)90%以上，且不含有HIV-1、HBV、HCV、支原體、細(xì)菌、酵母和真菌等。

培養(yǎng)信息：

包被條件 鼠尾膠原Ⅰ（2-5μg/cm2）

培養(yǎng)基 含FBS、生長添加劑、Penicillin、Streptomycin等

換液頻率 每2-3天換液一次

生長特性 貼壁

細(xì)胞形態(tài) 上皮細(xì)胞樣

傳代特性 可傳1-2代

消化液 0.25%

培養(yǎng)條件 氣相：空氣，95%；CO2，5%

注意事項：

1. 收到細(xì)胞后首先觀察細(xì)胞瓶是否完好，培養(yǎng)液是否有漏液、渾濁等現(xiàn)象，若有上述現(xiàn)象發(fā)生請及時和我們聯(lián)系。

2. 仔細(xì)閱讀細(xì)胞說明書，了解細(xì)胞相關(guān)信息，如細(xì)胞形態(tài)、所用培養(yǎng)基、血清比例、所需細(xì)胞因子等，確保細(xì)胞培養(yǎng)條件一致，若由于培養(yǎng)條件不一致而導(dǎo)致細(xì)胞出現(xiàn)問題，責(zé)任由客戶自行承擔(dān)。

3. 用75%酒精擦拭細(xì)胞瓶表面，顯微鏡下觀察細(xì)胞狀態(tài)。因運(yùn)輸問題，部分細(xì)胞由于溫度變化及劇烈碰亡破碎形成碎片，是正?，F(xiàn)象。觀察好細(xì)胞狀態(tài)后，75%酒精消毒瓶壁將T25瓶置于37℃培養(yǎng)箱放置4-6h。

4. 貼壁細(xì)胞可以消化，懸浮細(xì)胞直接混勻收集細(xì)胞，900 rpm-1000 rpm離心3 min，棄上清。加5 mL PBS重懸細(xì)胞，再900 rpm-1000 rpm離心3 min，，用新鮮的*培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，并接種到新的培養(yǎng)瓶或培養(yǎng)皿中，置于培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)。

5. 請客戶用相同條件的培養(yǎng)基用于細(xì)胞培養(yǎng)。

6. 建議客戶收到細(xì)胞后前3天各拍幾張細(xì)胞照片，記錄細(xì)胞狀態(tài)，便于和我司技術(shù)部溝通交流。由于運(yùn)輸?shù)脑颍瑐€別敏感細(xì)胞會出現(xiàn)不穩(wěn)定的情況，請及時和我們聯(lián)系，告知細(xì)胞的具體情況，以便我們的技術(shù)人員跟蹤回訪直至問題解決。

7. 該細(xì)胞僅供科研使用。

8. 備注：運(yùn)輸用的培養(yǎng)基(灌液培養(yǎng)基)不能再用來培養(yǎng)細(xì)胞，請換用按照說明書細(xì)胞培養(yǎng)條件新配制的*培養(yǎng)基來培養(yǎng)細(xì)胞。收到細(xì)胞后次傳代建議1：2傳代 。

9.注意： 1:2傳代就是1個T25瓶傳2個T25瓶或者2個6cm皿。不是1個T25瓶傳2個10cm皿。

公司正在出售的產(chǎn)品：

大鼠甘油-3-0酸脫氫酶(GAPDH)檢測試劑盒 ，英文名： GAPDH ELISA Kit

Pig superoxide dismase (SOD) ELISA Kit 豬超氧化物歧化酶(SOD)檢測試劑盒

流行性腮腺病毒(MV)核酸檢測試劑盒(PCR-熒光探針法) 48T

CLIAKitforM-CSF(MouseMacrophageColony-StimulatingFactor)ELISAKit小鼠巨噬細(xì)胞集落刺激因子

體液氏菌(SalmonellaTyphi)定性試劑盒20次

ELISAKitMHC綿羊主要組織相容性復(fù)合體

CD38重組人 SCARB3 蛋白 Protein

胰島素樣生長因子2-mRNA結(jié)合蛋白3(IGF2BP3)重組蛋白 Recombinant Insulin Like Growth Factor 2 mRNA Binding Protein 3 (IGF2BP3)

NA重組甲型流感 H1N1 神經(jīng)酶 (Neuraminidase / NA) (高活性) Protein

CD86 Protein Human 重組人 CD86 / B7-2 蛋白

Shiga toxin II subunit B Protein E. coli 重組腸出血性大腸桿菌 (EHEC) stx2B / Shiga toxin II subunit B 蛋白

胰島素樣生長因子2-mRNA結(jié)合蛋白3(IGF2BP3)重組蛋白 Recombinant Insulin Like Growth Factor 2 mRNA Binding Protein 3 (IGF2BP3)

CD86 Protein Human 重組人 CD86 / B7-2 蛋白

CD38重組人 SCARB3 蛋白 Protein

Shiga toxin II subunit B Protein E. coli 重組腸出血性大腸桿菌 (EHEC) stx2B / Shiga toxin II subunit B 蛋白

NA重組甲型流感 H1N1 神經(jīng)酶 (Neuraminidase / NA) (高活性) Protein

小鼠心肌肌鈣蛋白Ⅰ(cTn-Ⅰ)ELISA 試劑盒 96T/48T

Rat testoterone ELISA Kit (T) 大鼠睪酮(T)檢測試劑盒

Humanamiodarone,ADELISAKit 人呋酮(AD)檢測試劑盒 96T/48T 進(jìn)口分裝

ChickenC-ReactiveProtein,CRP檢測試劑盒雞C反應(yīng)蛋白(CRP)檢測試劑盒規(guī)格：96T/48T

載玻片細(xì)胞CASPASE-2蛋白表達(dá)熒光顯微鏡檢測試劑盒10/20次

MousehepatitisBvirussurfaceaibody,HBsAbELISAKit小鼠乙型肝表面抗體(HBsAb)檢測試劑盒規(guī)格：96T/48T

大鼠胰腺導(dǎo)管上皮細(xì)胞小鼠血管內(nèi)皮細(xì)胞粘附分子1(VCAM-1/CD106)檢測試劑盒   96T/48T   試劑盒   組裝/原裝

小鼠血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子受體-3(VEGFR-3)檢測試劑盒   96T/48T   試劑盒   組裝/原裝

小鼠血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子受體2(VEGFR-2)檢測試劑盒   96T/48T   試劑盒   組裝/原裝

小鼠血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子受體1(VEGFR-1)檢測試劑盒   96T/48T   試劑盒   組裝/原裝